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用二氧化碳培養(yǎng)箱做海馬神經(jīng)元細(xì)胞分離培養(yǎng)

更新時(shí)間:2024-04-11點(diǎn)擊次數(shù):987

海馬神經(jīng)元細(xì)胞分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
1、儀器
二氧化碳培養(yǎng)箱,解剖鏡,眼科鑷,眼科剪
2、動(dòng)物
新生鼠(SD大鼠)
3、耗材
DMEM/F12培養(yǎng)基、聚賴氨酸

實(shí)驗(yàn)步驟:
包被:培養(yǎng)前一天將培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶或皿用0.01%多聚賴氨酸包被過夜。第二天早上來吸除包被液在無菌超凈臺(tái)中自然晾干后放置于二氧化碳培養(yǎng)箱中備用。
配制神經(jīng)元專用培養(yǎng)基(DMEM/F12培養(yǎng)基中添加1%谷氨酰胺,2% B27,1%雙抗)
取腦:選取新生24h之內(nèi)的SD大鼠數(shù)只,雌雄不限,75%酒精全身消毒,斷頭處死,無菌條件下分層剪開頭皮,顱骨,用彎鑷?yán)_腦區(qū)視野,小心取出全腦,用預(yù)冷的PBS洗數(shù)次;
分離:以腦中線為起點(diǎn),小心撥開大腦顳葉皮層,暴露出新月狀海馬回,小心夾出海馬組織,置于預(yù)冷的PBS中,仔細(xì)剔除微血管,用眼科剪充分剪碎組織。
消化:加入同體積0.125%的胰蛋白酶,放入培養(yǎng)箱中消化30分鐘,期間每隔5分鐘輕搖一下。
過濾:加入數(shù)滴胎牛血清終止消化,用吸管輕輕吹打細(xì)胞數(shù)分鐘,至液體成米糊狀即停止吹打,動(dòng)作務(wù)必輕柔,用200目細(xì)胞篩過濾收集細(xì)胞懸液。
接種:1000rpm離心5分鐘,去除上清,用DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,輕輕吹打,調(diào)整細(xì)胞濃度為100000個(gè)每毫升,接種于包被好禁止晃動(dòng)。
換液:6小時(shí)后將DMEM/F12培養(yǎng)液全量換成神經(jīng)元專用培養(yǎng)液,第48小時(shí)后加入一定濃度的阿糖胞苷,以抑制非神經(jīng)元細(xì)胞過度生長,隨后每3天半量換液。

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